Клеточная инженерия

В 1960 г. французский ученый Ж. Барский установил, что соматические клетки животных способны объединять генетическую информацию двух родительских клеток. Такое явление было названо соматической гибридизацией. Затем выяснилось, что частота гибридизации значительно повышается при введении в смесь клеток частиц вирусов типа Сандай, индуцированных ультрафиолетом. Присутствие вируса способствовало слипанию клеток и их последующему слиянию друг с другом. Оказалась возможной гибридизация клеток различных видов организмов: крысы и мыши, мыши и человека, мыши и китайского хомячка. В лабораторных условиях были получены внутривидовые и межвидовые гибриды соматических клеток человека с клетками далеких видов — китайского хомячка, крысы, обезьяны, комара.

Из таких гибридных клеток не удается получить единый организм с суммой родительских признаков. Иными словами, искусственно еще не создан ни один монстр. Однако ученые проводят соматическую гибридизацию для размножения таких клеток на питательной среде, а также с целью изучения поведения разных хромосом в гибридной клетке.

При объединении в одной клетке геномов человека и мыши оказывается 86 хромосом, из них 46 хромосом человека и 40 — мыши. В процессе размножения количество хромосом в гибридной клетке изменяется. Чаще всего исчезают хромосомы человека, а хромосомы мыши сохраняются. Мы уже упоминали о таких опытах. Они дают возможность выяснить связь тех или иных генов человека с определенными хромосомами, установить группы сцепления, т. е. комплексы генов в каждой из хромосом, и в дальнейшем составить хромосомные карты человека.

Способность клеток объединяться и образовывать гибриды нашла широкое применение в иммунологии. Система   иммунитета   человека и   животных — это уникальный по универсальности механизм узнавания внедрившихся в организм чужеродных биоорганических веществ и выработки против них специфических реагентов антител.

Иммунная биотехнология включает три этапа: ввода, продукции и выхода. На вводе используют вещество, против которого необходимо наработать антитела. Как продуцирующий элемент длительное время применяли живые организмы — кроликов, лошадей, здоровых людей. Их иммунизировали, после чего у них брали кровь, из которой вырабатывали сыворотку, а затем и антитела. Совершенствование этого этапа иммунной технологии связано с созданием клеточных линий, вырабатывающих антитела и медиаторы иммунитета вне организма — в пробирках и клеточных реакторах. Выход антител оценивается довольно чувствительными и количественно точными радиоиммунным и иммунноферментным методами.

Современная иммунология ставит задачей направленную регуляцию иммунного ответа на определенный антиген. Это дает возможность практически решить проблемы трансплантационного, противоопухолевого и противовирусного иммунитета, различных иммуных заболеваний. Значительные перспективы открывает новое направление клеточной инженерии, связанное с созданием моноклональных (чистых) антител определенной специфичности. Для получения продуцентов таких антител конструируют гибридные клетки — гибридомы. В их образовании участвуют лимфоциты селезенки иммунизированных животных и раковые (миеломные) клетки. При слиянии этих клеток возникает гибридная клетка, способная размножаться как раковая и производить один-единственный тип антител — моноклональные антитела, представляющие родительскую плазматическую клетку.

Моноклональные антитела широко используют в практических целях. Их применяют для избирательной и высокочувствительной диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний. С их помощью получают иммуносорбенты для производства ферментов, гормонов, интерферонов и других биологически активных веществ. Созданы моноклональные антитела к одному из наиболее распространенных штаммов вируса гриппа, ведутся исследования по наработке моноклональных антител к важнейшим вирусам сельскохозяйственных растений.
В кардиологии антитела дают возможность диагностировать инфаркт миокарда, атеросклероз, осуществлять направленный транспорт лекарственных препаратов. Создаются химические «контейнеры», способные нести препарат в определенный участок организма. Показана принципиальная возможность переноса лекарства в поврежденные участки сосудистого русла.

Для выполнения таких сложных приемов создается комплекс липосомы (микроскопические пузырьки) с белком-вектором с его высокой избирательной способностью по отношению к поверхности поврежденного участка сердца. Как векторы для липосом используют антитела к коллагену — важнейшему компоненту поврежденного участка — и белок фибронектин, имеющий высокое сродство к коллагену. Комплексы липосома — фибронектин и липосома — антитело к коллагену избирательно накапливаются на поверхности коллагена ю культуре эндотелия или в поврежденной зоне сосуда, но не взаимодействуют с поверхностью эндотелиальных клеток.

Разработка гибридомной технологии — это, образно говоря, использование раковых клеток в борьбе с самим раком. Создана очень ценная гибридома на основе лимфоцитов-киллеров (лимфоцитов-убийц), обеспечивающих защиту организма от чужеродных клеток, в том числе раковых. Эти лимфоциты нападают на раковую клетку и вызывают ее гибель.

Другая интересная гибридома получена на основе лимфоцитов-киллеров от мышей, иммунизированных против определенной формы раковых клеток. Ее партнер — миеломные клетки мутантной линии NP. Образовавшаяся в результате слияния лимфоцитов-киллеров и миеломных клеток гибридома несколько лет живет и размножается в культуре, чего не могут сами лимфоциты. При введении в организм гибридома сохраняет противоопухолевую активность — основное свойство лимфоцитов-киллеров. С ее помощью удается предотвращать рак у подопытных животных.

В целом гибридомы представляют собой эффективный способ наработки вне организма антител и других биологических продуктов клеток иммунной системы — гормонов, медиаторов, биологически активных соединений.
Из гибридной клетки животных не удается получить организм, однако с помощью генетической инженерии научились создавать особи, у которых смешаны клетки разных типов. Например, созданы аллофенные мыши, содержащие генетически различные ткани. Эмбрионы мышей на определенной стадии развития извлекали из материнских организмов и с помощью специального фермента разделяли на отдельные клетки. Затем клетки от разных эмбрионов соединяли в единый комплексный эмбрион. Его пересаживали в матку мыши. Рождался мышонок с тканями белой и черной мышей.

Были созданы мыши с крысиными клетками. Животных облучали, у них гибли клетки крови и костного мозга. Им вводили клетки костного мозга крысы, которые начинали размножаться в мышином организме. Получалась мышь, в жилах которой текла крысиная кровь. В другом случае в яйцеклетки мыши ввели копии гена гормона роста крысы. Они внедрились в хромосомы мыши и начали функционировать. В итоге развивались гигантские мыши.
Конечно, никто не станет специально создавать огромных мышей, так же, как и пересаживать мухе гормоны слона, чтобы вырастить «мухослонов». Но такие генетические манипуляции со временем могут найти применение в животноводстве.

Клетки растений имеют более плотную оболочку и при смешивании не сливаются. В 1960 г. английскому ученому Э. Кокингу впервые удалось с помощью фермента разрушить целлюлозную оболочку и получить «голую» клетку — протопласт. Такие клетки могут легко сливаться друг с другом, а также поглощать находящиеся рядом макромолекулы и клеточные органеллы. Уже в 1970 г. удалось осуществить слияние протопластов овса и кукурузы. Культивирование протопластов в определенных условиях приводит к восстановлению клеточной оболочки, после чего клетки способны делиться и из них можно даже получить целое растение. Способность протопластов вбирать в себя из раствора различные частицы была использована для включения в них чужеродных ядер, хлоропластов, митохондрий, которые затем начинают размножаться. Если пересадить хлоропласта, взятые из обычного зеленого растения, в протопласты листа с нарушенным синтезом хлорофилла, через некоторое время в их клетках будет происходить нормальный процесс фотосинтеза. Таким образом, есть возможность более тонко исследовать различные структуры растительной клетки, изучить их взаимоотношение и специфические особенности, познать жизнедеятельность целого организма, выяснить механизмы его роста и развития.

В 1972 г. американский генетик П. Карлсон получил соматические клетки, объединяющие два вида табака, а затем вырастил из них взрослое растение. Оно содержало оба набора хромосом (24+18=42) и по внешнему виду было похоже на гибриды, созданные между этими видами половым путем. В дальнейшем Г. Мельхерс в ФРГ и Ю. Ю. Глеба в нашей стране на большом материале показали возможность контроля слияния протопластов и получения из них целых растений (используя метод культур изолированных клеток).

Уже первые эксперименты свидетельствовали об огромной перспективности метода. Скрещивание половым путем представителей отдаленных видов затруднено в связи с невозможностью оплодотворения яйцеклетки чужим спермием или с гибелью развивающегося зародыша. Соматическая гибридизация дает возможность преодолеть существующие генетические барьеры скрещиваемости растений разных видов и родов и получать настолько сложные гибриды, насколько хватает фантазии исследователя.

Существенная особенность соматических гибридов, отличающая их от половых — присутствие в гибридной клетке цитоплазмы   обеих   родительских   форм (половые гибриды имеют только цитоплазму материнского растения). В связи с этим наследственная основа их более обогащена.

Пользуясь методом слияния протопластов, можно осуществить гибридизацию растений, неспособных участвовать в скрещиваниях из-за нарушения у них процессов образования половых клеток или из-за неспособности к нормальному морфогенезу. Это положение было экспериментально подтверждено при получении соматических гибридов между гаплоидными растениями. Сами по себе гаплоиды стерильны — у них очень редко формируются функционально способные гаметы. Другой пример — клетки, у которых нарушено образование хлорофилла и которые поэтому способны размножаться только в искусственных условиях. Слияние протопластов таких клеток с нормальными дает возможность получать здоровые растения.

Несмотря на его перспективность, метод еще не получил практического применения. Главное внимание ученых направлено на отработку приемов слияния протопластов и отбора гибридных клеток, а также на получение убедительного доказательства гибридности полученных форм. Определено сходство соматических гибридов с половыми. Применяют генетические, цитогенетические, цитофотометрические и биохимические методы анализа соматических гибридов.

Прежде всего было установлено, что могут сливаться в одну клетку не только два, а три и более протопластов. Это сделал Мельхерс при слиянии протопластов гаплоидных растений табака. Подсчет количества хромосом показал, что большинство соматических гибридов — диплоиды, по найдены растения с четырьмя, а главное, тремя наборами хромосом. Кроме того, обнаружены гибридные клетки с ядром одного родителя, а цитоплазмой обоих, а также с ядром одного родителя, а цитоплазмой другого. К тому же при слиянии протопластов выявлены различные случаи сочетания ядерных геномов и цитоплазмы одной и обеих родительских форм.

Соматическая гибридизация происходит между растениями разных таксономических групп, но в дальнейшем судьба гибридных клеток существенно отличается. При гибридизации клеток близкородственных видов часто получаются нормальные фертильные растения, содержащие сумму наборов хромосом родительских клеток. В случае слияния клеток растений разных семейств и родов наблюдается постепенная элиминация (исчезновение) всех или большей части хромосом одного из родителей. Из таких клеток редко удается вырастить взрослые гибридные растения, а если они и образуются, то имеют пониженную жизнеспособность, стерильны. Тем не менее соматические гибриды отдаленных родителей небезинтересны в том отношении, что при утрате хромосом одного из родителей могут все же сохраниться отдельные небольшие участки хромосом, которые затем встроятся в оставшиеся хромосомы, а в результате произойдет перенос генов дальнородственных видов.

Несмотря на трудности получения гибридных растений при слиянии соматических клеток, некоторые результаты все же есть. В частности, пример создания соматического гибрида между мелким сорным растением арабидопсисом и турнепсом (оба из семейства крестоцветных). Сначала образовался каллус, затем проростки и растеньица причудливой формы с признаками обоих родителей.

Первые практические результаты получены при слиянии соматических клеток двух видов дурмана. Гибриды содержат на 20—25% больше алкалоидов по сравнению с родительскими формами и благодаря этому представляют собой ценный материал для промышленного получения скополамина. Другой практический успех связан с созданием межвидовых гибридов табака. Были слиты протопласты культурного табака и дикого вида, не скрещивающихся половым путем. Гибрид унаследовал от дикого вида устойчивость к болезням.

С помощью гибридизации соматических клеток культурного картофеля и диких форм получены исходные селекционные материалы, устойчивые к ряду заболеваний. В результате слияния протопластов синтезировали межвидовые гибриды петунии, которые не способны к скрещиванию половым путем. Селекционной орнаментальной форме растения был привнесен такой ценный признак другого вида, как разветвленный стелющийся тип стебля. При слиянии протопластов капусты и турнепса искусственно ресинтезировали естественный вид рапса.

Радужные надежды возлагались на межродовой гибрид между томатами и картофелем (томатофель). Представлялось, что ветви растения будут сгибаться под тяжестью плодов томатов, а на корнях вырастут внушительного размера клубни картофеля. Было несколько попыток получить такое чудо. После слияния протопластов удалось выделить растения с признаками обоих родителей. По количеству хромосом были отобраны экземпляры, у которых количество хромосом превышало общую сумму родительских форм, а также было ей равно. Гибриды оказались промежуточными между родителями по устойчивости к холоду и жаре. У первых томатофелей не было хороших «вершков» и «корешков». Но еще рано говорить о конечном результате. Можно сослаться на подобный пример отдаленной половой гибридизации редьки и капусты. Первые скрещивания, проведенные Карпеченко, не привели к практическому успеху, и все-таки впоследствии по такой же схеме получена новая кормовая культура куузикум — гибридная кормовая брюква. У нее очень ценными оказались и ботва, и корнеплод.

Известно 66 случаев создания соматической гибридизацией гибридных растений, из них 46 межвидовых, 3 межродовых, 12 межтрибных и 5 межсемейственных. Преобладают гибриды семейства пасленовых (у табака — 44, дурмана — 7, картофеля — 7, томатов — 3). Единичные гибриды получены у представителей семейства крестоцветных, зонтичных и бобовых. Во всех опытах использовали протопласты мезофилла листа или каллусной ткани.