Перенос генов в клетку

Как векторы для доставки генов в новые клетки обычно используют плазмиды — вирусоподобные структуры, представляющие собой кольцевые двунитчатые ДНК, способные к самостоятельному размножению в клетке. Довольно успешно в роли вектора можно использовать и обычные вирусы, например осповакцины. Структура и функция этого вируса оказались удобными для генноинженерных операций. Значительную часть генов можно удалить или заменить без ущерба для размножения вируса. При заражении клеток целым вирусом или одновременном введении в эти же клетки части генома вируса осповакцины, встроенного в плазмиду, происходит рекомбинация генетических структур. Это приводит к появлению клонов вируса осповакцины, несущих чужие гены. При встройке регуляторной части одного из генов вируса осповакцины чужой ген начинает функционировать, вызывая синтез определенного белка.

У высших растений вектором служит бактерия Агробактериум, содержащая плазмиды Ti или Ri. Образующая опухоли (корончатые галы) у многих двудольных растений Агробактериум тумефацием имеет большую плазмиду, часть которой (Т-район) в процессе формирования опухоли включается в ядерную ДНК растения. Установлено, что гены внутри Т-района можно значительно изменить и это влияет на способность передачи наследственного материала. Найдены участки, куда можно встраивать новые чужеродные части ДНК, которые необходимо ввести в геном растения.

Универсальный способ переноса генов в клетки низших организмов, животных и растений состоит в размножении (клонировании) генов и «пришивании» к ним участков ДНК, которые требуется ввести в новый геном. Такую ДНК вводят в клетку микроинъекцией или упаковывая ДНК в липосомы.

Чтобы ввести выделенный ген в новую клетку, конструируют гибридную или рекомбинантную молекулу ДНК. Впервые такую задачу выполнил в США П. Берг. Сначала была получена рекомбинантная ДНК животной и микробной клетки, затем ее вводили в животные клетки. Партнерами гибридной ДНК были ДНК вируса обезьяны и ДНК фага, содержащая галактозный ген бактерий кишечной палочки.

Соединить две молекулы ДНК в одну рекомбинантную удалось в результате использования принципа липких концов. Разработаны два метода образования липких концов с помощью применения различных ферментов: трансферазный, основанный на достройке однонитевого конца ДНК с участием трансферазы, и рестриктазный, использующий способность рестриктаз разрезать ДНК с образованием липких концов.

Размножают чужеродные гены, включенные в состав гибридных молекул ДНК, в бактериальных клетках. Скорость их размножения огромна. Главное условие функционирования чужеродных генов — копирование (репликация), переписывание (транскрипция) их информации на РНК и передача (трансляция) информации для синтеза кодируемого ими белка. Новый ген не имеет репликаторных участков для осуществления синтеза ДНК, у него отсутствует участок промотора, с которого начинается считывание последовательности нуклеотидов.

Эти недостатки, препятствующие функционированию чужеродных генов в клетке, были преодолены использованием недостающих генетических структур у векторов. Для размножения генов или отдельных фрагментов ДНК в бактерии кишечной палочки как векторы используют плазмиды, космиды и бактериофаг лямбда. Несмотря на значительное различие этих векторов по величине и строению, общими для всех является способность автономно размножаться в бактерии, простота отделения от нуклеиновых кислот бактерии и малый размер их ДНК.

Плазмиды представляют собой внехромосомные генетические элементы, способные встраиваться во множество видов бактерий. Это двухцепочечпые замкнутые кольцевые молекулы ДНК, размер которых существенно варьирует. Космиды имеют больший размер, их используют для клонирования больших фрагментов ДНК. Бактериофаг лямбда — вирус, содержащий двухцепочечную ДНК.